Técnica Molecular Epigenómica

La tecnología CRISPR/Cas9 es una herramienta molecular utilizada para “editar” o “corregir” el genoma de cualquier célula. Eso incluye, claro está, a las células humanas. Sería algo así como unas tijeras moleculares que son capaces de cortar cualquier molécula de ADN haciéndolo además de una manera muy precisa y totalmente controlada.  Esa capacidad de cortar el ADN es lo que permite modificar su secuencia, eliminando o insertando nuevo ADN.

El uso de las estrategias CRISPR-Cas9 desarrolladas para la eliminación del ADN proviral del VIH-1 se ve favorecido por el control óptimo de la replicación viral que conduce a una latencia viral sostenida.

La técnica CRISPR-Cas9 tiene dos componentes. El primero es una enzima –la Cas9– que funciona como unas tijeras moleculares que cortan el ADN. (En la naturaleza, las bacterias utilizan el sistema CRISPR-Cas9 para cortar y desactivar el código genético de los virus invasores.) El otro consiste en un ARN guía que dirige esas tijeras (Cas9) hacia la secuencia de nucleótidos (las "letras" que conforman el ADN) específica que se pretende cortar.

BIBLIOGRAFÍA:

1. Specter M. La revolución del ADN. [Online]; 2018. Acceso el 28 de noviembre de 2019. Disponible en: https://www.nationalgeographic.com.es/ciencia/grandes-reportajes/revolucion-del-adn_10762/1

2. Dash P, Kaminski R, Gendelman H. Los tratamientos secuenciales de ARTE LÁSER y CRISPReliminan el VIH-1 en un subconjunto de ratones humanizados infectados. Nature Communications. 2019. 10(2753)

Prueba molecular: Microarray

El microarray del VIH debería ser útil para estudiar las respuestas de anticuerpos a múltiples antígenos y epítopos del VIH en pacientes infectados por el VIH para explorar los mecanismos de la enfermedad, para el diagnóstico y para el seguimiento del tratamiento y de los ensayos de vacunas. El microarray de VIH permite la detección simultánea, sensible y específica de respuestas de anticuerpos para las principales clases de inmunoglobulinas (IgG, IgA, IgM, IgE) y subclases (IgG 1-4 ) con pequeñas cantidades de muestras de suero hacia una gran cantidad de VIH antígenos y péptidos.

BIBLIOGRAFÍA:

Gallerano D, Wollmann E, Lupink C, Schlederer T, Ebner D, Harwanegg C, Niespodziana K, Schmetterer K, Pickl W, Puchhammer-Stöckl E,  Sibanda E, Valenta R. Microarrays de VIH para el mapeo y caracterización derespuestas de anticuerpos específicos de VIH. 2015; 15(6).

PCR para VIH

Tema: Optimización de la técnica de PCR reversa para la detección de VIH en plasma de pacientes infectados

Objetivo: Evaluar la viabilidad de realizar un PCR para el ADN del VIH-1 con el fin de diagnosticar la enfermedad y proporcionar un tratamiento adecuado para la misma.

Muestra: Plasma

Tipo de ácido nucleico: ADNc

Gen a amplificar: env 336pb

Cebador azaroso (random primer) y enzima RT "SuperScript" TM (200 U/uL)

Extracción del ADN: QIAGen QIAmp Viral RNA Mini Kit

PCR: RT-PCR

• Desnaturalización: 1 ciclo de 2 minutos a 95°C y 35 ciclos de 30 segundos a 95°C
• Hibridación: 35 ciclos de 30 segundos a 55°C
• Elongación: 35 ciclos de 60 segundos a 72°C

Visualización por electroforesis: EFO en gel de agarosa al 2%

Sensibilidad analítica: 93,5% 

Especificidad analítica: 91,7%

BIBLIOGRAFÍA:

Ameli G, Gutiérrez C, D'Angelo P, Rangel, H. Optimización de la técnica de PCR reversa para la detección de VIH en plasma de pacientes infectados. Redalyc. 2013; 33(2)

Prueba de tamizaje y confirmatoria

PRUEBAS DE TAMIZAJE

-Pruebas rápidas: su tiempo de ejecución es de 20 minutos o menos, no necesitan equipamiento (pueden realizarse fuera del laboratorio) y tienen incorporados sistemas de control de calidad interno. En general, tienen una sensibilidad comparable con las pruebas de ELISA, pero su especificidad suele ser menor.

-ELISA: Se caracterizan por una alta sensibilidad, cercana al 100%, y una buena especificidad (99,5%). La especificidad depende de la calidad del antígeno que contiene la prueba, que es el componente que define su generación; hoy sólo son aceptables los ELISA de tercera y cuarta generación.

-Antigenemia p24: Es una prueba altamente específica pero su sensibilidad no es óptima, presentando falsos negativos; limitándose su uso al diagnóstico precoz durante el periodo de ventana, cuando hay signos clínicos de primoinfección o presunción de exposición.

-Quimioluminiscencia: Es un método automatizado basado en el principio de emisión luminosa a través de una reacción enzima-sustrato; es más sensible que los ELISA, por eso un resultado no reactivo es más confiable, y es muy específico.

PRUEBAS CONFIRMATORIAS:

-Inmunofluorescencia indirecta: Su positividad constituye diagnóstico definitivo de la infección por el VIH y la negatividad, en general, también es definitiva de no infección, excepto cuando existe evidencia de exposición reciente y reiterada, en tales circunstancias se recomienda repetir el ensayo luego de tres y seis meses respectivamente.

-Western Blot: Es una prueba altamente especifica pero por su alto costo se emplea básicamente para corroborar los resultados indeterminados de la IFI. El resultado positivo confirma definitivamente la infección por el VIH; el negativo la descarta, excepto cuando existe evidencia de exposición reciente y reiterada a esta infección. En tales circunstancias se debe repetir el ensayo luego de tres y seis meses respectivamente.

BIBLIOGRAFÍA:

Ricardo Á. Interpretación de las pruebas usadas para diagnosticar la infección por virus de la inmunodeficiencia humana. Scielo. 2017; 34(4).

Alteraciones de la Epigenómica en el VIH

La hipermetilación puede ocurrir en el genoma del VIH integrado, lo que puede explicar la latencia del virus en infecciones crónicas. En detalle, las repeticiones terminales largas del VIH (LTR) se hipermetilaron en los sitios CpG en el 5'-LTR pero no en el 3'-LTR. Además, la desmetilación de los sitios CREB / ATF en el LTR también se ha demostrado como un paso crucial para la reactivación del genoma del VIH-1 latente in vivo. Se informó que el VIH-1 desencadena la hipermetilación de algunos genes del huésped, por ejemplo, la infección por VIH-1 de las células linfoides podría conducir al aumento de la expresión de DNMT, así como la hipermetilación y expresión reducida de FOXP3, IFN-γ y p16INK4A.
BIBLIOGRAFÍA:

Zhang Y, Li SK, Yi Yang K, Liu M, Lee N, Tang X, et al. Toda la matriz de metilación del genoma revela la baja regulación de IGFBP6 y SATB2 por VIH-1. Scientific Reports. 2015; 5(10806).